A New York, Hamato Yoshi, un maître ninja japonais, est assassiné par son rival. Splinter, le rat de compagnie de Yoshi, qui a appris le ninjutsu en observant et mimant son maître, réussit à s'échapper et se réfugie dans les égouts.
Plus tard, il découvre par hasard quatre bébés tortues tombées dans un produit mutagène suite à un accident. Les prenant en pitié, il les tire du liquide et les recueille, s'exposant lui-même à la substance dans le procédé. Par la suite, sous l'effet du mutagène, les cinq animaux mutent peu à peu, jusqu'à développer un aspect anthropomorphique, ainsi qu'une intelligence et une dextérité humaine. Splinter devient alors le père adoptif des tortues, qu'il élève et entraîne aux arts martiaux afin qu'ils puissent survivre à un environnement qui ne les acceptera jamais.
Splinter ayant un livre sur l'art de la Renaissance, les tortues mutantes sont baptisées de noms de peintres de cette époque : Michelangelo (Michel-Ange), Leonardo (Léonard de Vinci), Raphael (Raffaello Sanzio) et Donatello (Donato di Niccolò di Betto Bardi dit "Donatello"). Fait historique à noter, Donatello ne serait pas considéré comme un peintre de la Renaissance, vu qu'il est décédé en 1466, que la Renaissance a débuté en 1400 et que son style n'est pas typique de la Renaissance. Cependant, les auteurs ne s'entendent pas sur cette interprétation historique.
Les tortues sont chacune spécialisées dans l'utilisation d'une arme précise (le katana par Leonardo, le sai par Raphael, le bō par Donatello et le nunchaku par Michelangelo), et portent des bandanas qui sont tous rouges dans le comic original, mais prennent une couleur propre à c